猫爪草粗多糖治疗自身免疫性甲状腺炎的实验

2020-5-20 来源:不详 浏览次数:

猫爪草粗多糖治疗自身免疫性甲状腺炎的实验研究

冯艺萍,郭丽雯,潘慧文

(广西科技大学,广西柳州)

摘要:目的

研究猫爪草粗多糖对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)小鼠免疫干预作用。

方法:

雌性BALB/C小鼠多点皮下注射甲状腺球蛋白辅以佐剂,配合饮用高碘水,形成实验性自身免疫性甲状腺炎模型,用药干预。用化学发光法检测实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠血清甲状腺素(TT4)、三磷甲状腺原氨酸(TT3)、游离甲状腺素(FT4)、游离三碘甲状腺原氧酸(FT3)、高灵敏人促甲状腺激素(TSH);用放射免疫法检测抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、抗甲状腺微粒体抗体(TMAb)。

结果:

与正常组相比,实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠血清甲状腺素、游离甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸显著降低(P0.01),高灵敏人促甲状腺激素、抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体显著升高(P0.01);三碘甲状腺原氨酸与正常组无显著性差异。用药治疗后,与模型组相比,猫爪草粗多糖各剂量组甲状腺素、游离甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸水平显著回升(P0.01),抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体水平仍旧处于高位。

结论:

实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠处于甲减状态,猫爪草粗多糖能在一定程度上干预实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠的甲状腺激素水平,有利于其恢复,其作用可能与其抗炎及免疫调节功能有关。

关键词:

猫爪草;粗多糖;自身免疫性甲状腺炎;BALB/c小鼠

中图分类号:R.5文献标识码:A文章编号:-()10--

doi:10./j.cnki.jpr..10.

猫爪草(RanunculiternatiRaei)为毛茛科植物小毛茛(RanunculusternatusThunb)的干燥块根,别名金花草(广西)[1]。文字记载首见于《中药材手册》[2],《中国药典》年开始收载,《中国药用植物志》《广西中药志》《河南中草药手册》《湖北植物志》等也有记载。其味甘、辛,性温,入肝、肺二经,具有清热解毒、化瘀消肿的功效,故可清肝泻火、散结消瘿。经典方剂如活血消瘿方、甲肿消、理气消瘿片、瘿气灵等方中均有猫爪草成分,本研究通过实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)小鼠模型考察猫爪草粗多糖对甲状腺激素及相关抗体水平的影响,为民族药材的开发利用提供实验依据。

1实验材料

1.1实验动物BALB/c小鼠[SPF级,雌性,体重(20±2)g]由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,生产许可证:SCXK(湘)-,动物使用许可证号:SYXK(桂)-。分笼饲养,室温22-25℃,日光灯照明12h明暗交替环境,自由饮食。

1.2主要试剂及药品甲状腺球蛋白(TG,博奥森):弗氏完全佐剂(CFA)弗氏不完全佐剂(IFA)均购自Sigma公司;磷酸盐缓冲液(PBS,Gibco公司):总三碘甲状腺原氨酸(TT3,批号(LOT)、总甲状腺素(TT4),批号:LOT)游离三碘甲状腺原氨酸(FT3,批号:LOT)、游离甲状腺素(FT4),批号:LOT)均购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司:甲状腺球蛋白抗体(TGAb,天津九鼎医学生物工程有限公司,批号(RTA);甲状腺微粒体抗体(TMAb,天津市协和医药科技集团有限公司,批号:);促甲状腺素(TSH,深圳市新产业生物医学工程股份有限公司,批号:);碘化钾(KI,成都市科龙化工试剂厂,批号:041);醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药有限公司,批号:);猫爪草(广西柳州百草堂药业有限公司中药饮片厂,批号5)。

1.3实验仪器DFM-96放射免疫γ计数器(合肥众成机电技术开发有限公司);全自动化学发光测定仪(型号:MaglumiPlus,深圳市新产业生物医学工程有限公司);全自动化学发光系统(型号Dxl,美国贝克曼库尔特)。

2实验方法

2.1猫爪草粗多糖提取[4]猫爪草(经广西中医药研究院严克俭副主任药师鉴定)粉碎,过60目筛,加12倍水浸泡1h,于恒温水浴箱℃加热回流提取3h,过滤,取上清,复提1次,合并水煎液减压浓缩至g·L-1,放冷,搅拌并加乙醇使含醇量达50%,静置6h(密闭冷藏),取上清,低温减压浓缩至生药1.8g·mL-1,于4℃冰箱保存。采用苯酚-硫酸法测定猫爪草粗多糖含量(以葡萄糖计),得率为5.3%。

2.2EAT动物模型的建立BALB/c小鼠60只,适应性饲养1周后,随机分为6组(每组10只):模型组、地塞米松(1mg·kg-1)阳性对照组、猫爪草粗多糖1、0.5、0.25g·kg-13个剂量组。正常组10只,以PBS模拟免疫注射,饮用高压灭菌水。其余50只造模,以TG(溶于PBS)与CFA等剂量充分混合制成油包水乳剂,对小鼠两后足跖皮下、颈部皮下、背部皮下、腰侧皮下等部位多点免疫注射(TG按μg/鼠/次计),每周1次,连续两周;第三周以TG(溶于PBS)与IFA等剂量充分混合制成油包水乳剂,再次免疫注射(TG按50μg/鼠计),每周1次,连续两周;造模期间饮用高碘水(0.64g·L-1)[5]

2.3药物治疗各组小鼠灌胃给予相应的药物溶液,10mL·kg-1每天给药1次,连续给药4周,模型组和正常组给予等容积的生理盐水。

2.4指标检测

2.4.1小鼠甲状腺激素及抗体水平的检测摘眼球取血,室温放置20mim,rpm离心10min,取上清。用化学发光法检测甲功五项:甲状腺素(TT4)、三碘甲状原氨酸(TT3)、促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4),放射免疫法检测抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、抗甲状腺微粒体抗体(TMAb)。

2.4.2甲状腺病理组织学检查取小鼠甲状腺组织,用10%福尔马林液固定,常规取材,脱水,石蜡包埋,制片(4μm),苏木素一伊红(HE)染色,封片,光学显微镜下阅片,观察小鼠甲状腺病理组织形态学变化。

2.4.3统计方法应用SPSS20.0软件进行统计学处理,数据以均数±标准差(`x±s)表示,组间比较用单因素方差分析,P0.05为差异有显著性意义,P0.01为差异性有非常显著性意义。

3实验结果

3.1小鼠体征变化与正常组相比,造模各组小鼠从第3天开始,出现厌食、毛发无光、湿漉成束、倦俯少动等症;1周后易怒、注射位有硬结凸起、有脱毛现象;第3周小鼠饮食、活动、粪尿均增加,个别鼠有突眼症。用药治疗两周后,与模型组相比,药物治疗各组仍有少许脱毛现象,但其余活动逐渐趋于正常。

3.2猫爪草粗多糖对EAT小鼠血清甲状腺激素水平的影响与正常组比较,模型组小鼠TT4、FT4、FT3显著降低(P0.01),TSH显著升高(P0.01),TT3无显著性差异;与模型组比较,地塞米松阳性对照组和猫爪草粗多糖各剂量组FT3、TT4、FT4值显著升高(P0.01),但TSH仍处于高位,结果见表1。

表1猫爪草粗多糖对EAT小鼠血清TSH、TT3、TT4、FT3、FT4的影响

(`x+s,n=10)

组别

剂量

TSH/mIU.L-1

TT3/nmol..L-1

FT3/pmol.L-1

FT4/pmol.L-1

正常组

_

0.02±0.01

2.58±0.49

.68±28.49

.84±13.24

模型组

_

0.08±0.02△△

2.43±0.38

.13±55.96△△

68.35±1.75△△

地塞米松组

1mg.kg-1

0.07±0.01

2.05±0.42

.47±22.20**

.96±9.84**

1g.kg-1

0.06±0.00

2.43±0.74

.40±65.42**

.95±30.82**

貓爪草粗多糖

0.5g.kg-1

0.06±0.01

3.18±0.30

.16±88.33**

.59±18.90**

0.25g.kg-1

0.04±0.02

2.83±0.51

.06±52.05**

.49±**

注:与正常组比较,△△P;与模型组比较,*P0.05,**P0.01。

3.3猫爪草粗多糖对EAT小鼠血清甲状腺抗体的影响与正常组比较,造模组小鼠血清TGAb、TMAb水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,地塞米松阳性对照组和猫爪草粗多糖各剂量组抗体水平仍处于高位,无显著性差异,结果见表2。

表2猫爪草粗多糖对EAT小鼠血清TGAb、TMAb的影响(`x+s,n=10)

组别

给药

TGAB/%

TMAB/%

正常组

NS

0.18±0.07

0.27±0.06

模型组

NS

55.84±8.66△△

44.01±3.59△△

地塞米松组

1mg.kg-1

49.83±1.86

34.47±2.47

猫爪草粗多糖高剂量组

1g.kg-1

56.69±5.63

40.81±25.72

猫爪草粗多糖中剂量组

0.5g.kg-1

48.25±4.14

33.40±2.06

猫爪草粗多糖低剂量组

0.25g.kg-1

53.43±2.36

37.66±4.01

注:与正常组比较,△△P0.01

3.4猫爪草粗多糖对EAT小鼠甲状腺病理组织形态学的影响光镜下,正常组小鼠甲状腺组织可见类圆形或不规则形、大小不一的甲状腺滤泡,结构完整,腺泡腔内充满透明的胶质且分布均匀,无淋巴细胞浸润;模型组小鼠甲状腺淋巴组织增生伴淋巴滤泡形成;猫爪草粗多糖中低剂量组可见有淋巴细胞浸润,但明显少于模型组;猫爪草粗多糖高剂量组及地塞米松阳性对照组甲状腺滤泡排列规则,滤泡上皮细胞结构保持完整,几乎看不到淋巴细胞浸润,结果见图1。

4讨论

自身免疫性甲状腺炎是由于自身免疫功能素乱引起的甲状腺疾病,以甲状腺组织损伤和甲状腺自身抗体水平升高为主要特点。小鼠甲状腺位于甲状软骨与气管连接处,附着在该位置左右两侧,颜色与周边肌肉组织相近,与人体甲状腺相比,无明显甲状腺峡及锥状叶。本实验选择EAT易感品系BALB/c?性小鼠[6],通过TG联合弗氏佐剂多点皮下注射进行免疫诱导,同时给予高碘环境,EAT小鼠血清存在高水平TGABb、TMAb,甲状腺组织存在炎症细胞浸润,显示成功[7]建立EAT模型。

TGAb、TMAb是甲状腺发生慢性炎症时,滤泡内的甲状腺球蛋白进入血液或细胞内的甲状腺微粒体蛋白向外周泄露,刺激免疫系统而产生的抗体,通过细胞毒性效应(ADCC),对甲状腺组织产生破坏作用,导致甲状腺机能减退。本研究显示,EAT小鼠经药物治疗后,甲状腺激素水平有一定的回升,但TSH水平仍然偏高,说明下丘脑-垂体-甲状腺轴的恢复在短期内尚无法实现,免疫应答仍然存在,因此,TGAb、TMAb值在自身免疫甲状腺炎疾病诊断中虽有重要意义,但经药物治疗后与治疗前并无显著变化[8],仍保持较高滴度,因此不建议把TGAb、TMAb值作为甲减患者治疗效果的实时检测指标,可定期复查,判断疾病转归。

甲功五项是甲状腺的五项健康情况检测数据,分别指TT4、TT3、TSH、FT3、FT4的测定,该五项指际联检是一种较为准确的评价甲状腺功能的方法[9]。模型组EAT小鼠血清TSH水平升高,FT4尤其TT4水平降低,表示其处于临床甲减状态。我们根据猫爪草的药典最大生药用量g·(60kg)-1及结合动物实验小鼠给药剂量是人给药剂量的9.1倍,确定猫爪草小鼠高剂量为生药18g·kg-1,折算成猫爪草粗多糖(得率5.3%)高剂量为1g·kg-1,并倍量递减得中、低剂量。现已有研究表明猫爪草多糖具有较强的抗炎[10]及免疫调节作用[11],本研究所采用的提取方法主要提得物为猫爪草粗多糖[4],猫爪草各剂量组连续给药4周后,EAT小鼠血清FT3、TT4、FT4水平增高,变化趋势与地塞米松阳性对照组相同,与模型组有显著性区别(P0.01),说明猫爪草粗多糖对甲状腺激素的降低有抑制作用,能在一定程度上调EAT小鼠甲状腺激素水平,有效干预自身免疫性甲状腺炎的病变。

参考文献:

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国家卫生部药政管理局,中药材手册[M].北京:人民卫生出版社,:。

邓家刚,韦松基,桂药原色图鉴[M].上海:上海科学技术出版社,:-。

刘菊,王君明,纪彬,等.猫爪草粗多糖提取工艺研究[J],中医学报,,27(12);-。

滕晓春.慢性碘过量对具有自身免疫性甲状腺炎遗传倾向的NOD.H-2h4小鼠甲状腺能和形态影响的实验研究[D].北京:中国医科大学,。

邓莉,孙文,侯毅,等,自身免疫性甲状腺炎实验动物模型的研究进展[J].天津中医药,,33(3):-。

叶登美,王萍,陈京,等,小鼠自身免疫性甲状腺炎模型构建[J].皖南医学院学报,,34(1):10-12

张敏,罗嘉,段雨函TGAb、TMAb、TPAb水平与Graves病治疗后甲状腺功能减退发生率的相关性研究.检验医学与临床,,14(6):-。

蔡呈香.TSH与FT3、FT4、T3、T4联检甲状腺机能及临床应用[J]放射免疫学杂志,,13(5):-。

杨嘉,沈秀明,吴钢,等,复方猫抓草水提物抗炎作用与急性毒性的探讨[J].中草药,,31(10):-。

吕小华,王会敏,韩红霞猫爪草多糖免疫调节及抗氧化活性研究[J].中国中药杂志,,35(14):-。

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